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最新的蛋白质稳定性分析技术
NanoDSF---Prometheus
nanoDSF的优点：
l 天然环境下进行检测，无需染料，消除缓冲液和去垢剂的干扰l 更高的分辨率，更详细的转变期数据 l 更快获得结果，更少的样品消耗量 l 更加广泛浓度范围内的精确测量，5ug/ml-150mg/ml  |
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| 天然环境下的DSF技术 | |
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nanoDSF是一种更加高级的差示荧光扫描技术。该技术通过检测色氨酸自发荧光的微小变化来进行蛋白质稳定性的研究。 蛋白质中的色氨酸荧光强度与它们周围的环境息息相关，因此，可以通过检测色氨酸的荧光变化，实现在无需标记的情况下评估蛋白质的化学和热稳定性。 由nanotemper公司开发的双通道UV技术通过实时荧光检测，以及无与伦比的扫描速度和数据点密度，实现了去折叠曲线的超高分辨率，甚至可以检测到瞬间的去折叠信号。 此外，由于不需要第二个荧光基团作为信号源，因此，检测过程不受缓冲液成分的影响，可以用于去垢剂溶解的膜蛋白和高浓度抗体制剂的稳定性分析，并且可以适用非常宽广的浓度范围，从150mg/ml至5μg/ml。 |
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| 应用实例：淀粉酶的热稳定性分析 | |
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图例：两种淀粉酶亚型的晶体结构和热稳定性 （A）330 和350 nm两个波长的数据记录。两个波长下的荧光值比值跟温度进行绘图。第一个拐点用于确定Tm值。 （B）当单波长数据不能清晰的显示去折叠转换过程时，350/330 nm荧光值的比值能够得到明确的折叠状态转换过程。 蛋白变性曲线可用于获得重要的稳定性参数。我们通常使用Tm值——熔解温度这一概念来描述给定蛋白质的热稳定性，意即一半蛋白值去折叠时的温度。 Tm值可以通过检测色氨酸荧光强度的变化或者色氨酸荧光在330和350nm波长荧光值的比值来确定。荧光值的比值显示了色氨酸荧光在去折叠过程中的转变。 通常情况下，在蛋白质去折叠过程中，350/330nm比值能够得到非常明确的去折叠转换过程，而单波长检测方不总能获得精准的Tm值。所以Prometheus NT.48的双波长检测系统是一种高灵敏度的检测去折叠过程的方法。 |
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| 应用实例：淀粉酶在不同缓冲液条件下的稳定性 | |
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图例：米曲霉（Aspergillus oryzae）淀粉酶TAKA在不同缓冲液条件下的稳定性 （A）Tm值减小表明移除Ca2+离子导致淀粉酶稳定性明显下降。 （B）为了获得高热稳定性的缓冲液条件，检测了淀粉酶在5个不同蔗糖浓度下的去折叠过程。 Prometheus NT.48去折叠数据的精确性和可重复性 （A）分别独立测定10次PPA和TAKA熔解曲线的叠加图。 （B）测定两个蛋白的Tm值显示实验间的标准偏差非常小（≤0.2℃），与已发表的数据高度一致（Fitter, J., Structural and dynamical features contributing to thermostability in alpha-amylases. Cell Mol Life Sci, 2005. 62(17): p. 1925-37.）。 |
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| 部分发表文章 | |
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1. Alexander, C. G., Wanner, R., Johnson, C. M., Breitsprecher, D., Winter, G., Duhr, S., Baaske, P., and Ferguson, N. (2014) Novel microscale approaches for easy, rapid determination of protein stability in academic and commercial settings. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics 1844, 2241-2250
2. Martin, L., Schwarz, S., Breitsprecher, D. (2014) Analyzing Thermal Unfolding of Proteins: The Prometheus NT.48. Application Note NT023
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